Bước tới nội dung

Thành viên:Naazulene/Thử nghiệm Ames

Bách khoa toàn thư mở Wikipedia
Trang này viết về một thử nghiệm để xét tính gây đột biến của chất hóa học. Đối với sự tinh chế kim loại Uranium, xem Ames process.

Thử nghiệm Ames

Trang này viết về tuhử nghiệm để xét tính gây đột biến của chất hóa học. Đối với sự tinh chế kim loại, xem Ames process.
Qui trình thực hiện thử nghiệm Ames

Thử nghiệm Ames là phương pháp phổ biến để đánh giá tiềm năng gây đột biến của một chất hóa học, sử dụng vi khuẩn làm vật thí nghiệm.[1]

A positive test indicates that the chemical is mutagenic and therefore may act as a carcinogen, because cancer is often linked to mutation. The test serves as a quick and convenient assay to estimate the carcinogenic potential of a compound because standard carcinogen assays on mice and rats are time-consuming (taking two to three years to complete) and expensive. However, false-positives and false-negatives are known.[2]

The procedure was described in a series of papers in the early 1970s by Bruce Ames and his group at the University of California, Berkeley.[3][4][5][6]

Qui trình chung

[sửa | sửa mã nguồn]

Thử nghiệm Ames sử dụng một số chủng vi khuẩn Salmonella typhimurium có thể mang đột biến gen liên quan đến tổng hợp histidine. Khiến chúng khuyết dưỡng axit amin này, có nghĩa là chúng cần histidine để sinh sản và phát triển, nhưng không thể tự sản xuất. Phương pháp này xác định khả năng gây đột biến của chất hóa học dựa theo khả năng chúng tạo đột biến để vi khuẩn trở lại nguyên dưỡng, tức có thể sống ở môi trường không có histidine.

Những chủng vi khuẩn thí nghiệm được đặc biệt thiết kế để những đột biến lệch khung (ví dụ chủng TA-1537 và TA-1538) hoặc đột biến điểm (ví dụ chủng TA-1531) sẽ khiến chúng tổng hợp được histidine, nhằm dò ra những tác nhân đột biến thuộc nhiều cơ chế khác nhau. Ngoài ra, chúng còn thường mang đột biến làm giảm khả năng tổng hợp lipopolysaccharide, khiến thành tế bào dễ bị xâm nhập hơn,[5] và đột biến ở hệ thống sửa sai nucleotide để thí nghiệm nhạy cảm hơn (trong trường hợp tác nhân gây đột biến ở tần số thấp).[6] Một số chất gây đột biến thể hiện rất cụ thể, gây hồi biến (đột biến làm mất tác dụng của đột biến ban đầu) ở chỉ một hoặc hai chủng.[4]

Những sinh vật lớn hơn như thú có vú có những quá trình chuyển hóa có thể khiến chất bình thường thành tác nhân đột biến hoặc ngược lại;[7] nên để kết quả thí nghiệm mang tính kết luận hơn về tác dụng của chúng trên sinh vật lớn, người ta thường thêm enzyme gan chuột vào một tường nuôi cấy để giả lập những quá trình chuyển hóa trong cơ thể chúng, bởi vì một số chất, ví dụ như benzo[a]pyrene, không gây đột biến, nhưng sản phẩm chuyển hóa của chúng lại có.[3]

Trong thử nghiệm này, vi khuẩn sẽ được để lên đĩa agar với một lượng nhỏ histidine. Lượng histidine nhỏ này sẽ chỉ đủ cung cấp cho vi khuẩn trong một khoảng thời gian ngắn, đủ để chúng có cơ hội đột biến. Một khi histidine hết, chỉ những vi khuẩn nào đã bị đột biến do tác nhân trong thí nghiệm mới có thể sống sót tiếp. Dĩa thạch sẽ được ủ trong 48 giờ. Tính gây đột biến của chất được thể hiện qua số lượng khuẩn lạc trong dĩa thạch cuối cùng.

Ames test and carcinogens

[sửa | sửa mã nguồn]

Mutagens identified via Ames test are also possible carcinogens, and early studies by Ames showed that 90% of known carcinogens may be identified via this test.[8] Later studies however showed identification of 50–70% of known carcinogens.[cần dẫn nguồn] The test was used to identify a number of compounds previously used in commercial products as potential carcinogens.[9] Examples include tris(2,3-dibromopropyl)phosphate, which was used as a flame retardant in plastic and textiles such as children's sleepwear,[10] and furylfuramide which was used as an antibacterial additive in food in Japan in the 1960s and 1970s. Furylfuramide in fact had previously passed animal tests, but more vigorous tests after its identification in the Ames test showed it to be carcinogenic.[11] Their positive tests resulted in those chemicals being withdrawn from use in consumer products.

One interesting result from the Ames test is that the dose response curve using varying concentrations of the chemical is almost always linear,[8] indicating that there is no threshold concentration for mutagenesis. It therefore suggests that, as with radiation, there may be no safe threshold for chemical mutagens or carcinogens.[12][13] However, some have proposed that organisms could tolerate low levels of mutagens due to protective mechanisms such as DNA repair, and thus a threshold may exist for certain chemical mutagens.[14] Bruce Ames himself argued against linear dose-response extrapolation from the high dose used in carcinogenesis tests in animal systems to the lower dose of chemicals normally encountered in human exposure, as the results may be false positives due to mitogenic response caused by the artificially high dose of chemicals used in such tests.[15][16] He also cautioned against the "hysteria over tiny traces of chemicals that may or may not cause cancer", that "completely drives out the major risks you should be aware of".[17]

The Ames test is often used as one of the initial screens for potential drugs to weed out possible carcinogens, and it is one of the eight tests required under the Pesticide Act (USA) and one of the six tests required under the Toxic Substances Control Act (USA).[18]

Limitations

[sửa | sửa mã nguồn]

Salmonella typhimurium is a prokaryote, therefore it is not a perfect model for humans. Rat liver S9 fraction is used to mimic the mammalian metabolic conditions so that the mutagenic potential of metabolites formed by a parent molecule in the hepatic system can be assessed; however, there are differences in metabolism between humans and rats that can affect the mutagenicity of the chemicals being tested.[19] The test may therefore be improved by the use of human liver S9 fraction; its use was previously limited by its availability, but it is now available commercially and therefore may be more feasible.[20] An adapted in vitro model has been made for eukaryotic cells, for example yeast.

Mutagens identified in the Ames test need not necessarily be carcinogenic, and further tests are required for any potential carcinogen identified in the test. Drugs that contain the nitrate moiety sometimes come back positive for Ames when they are indeed safe. The nitrate compounds may generate nitric oxide, an important signal molecule that can give a false positive. Nitroglycerin is an example that gives a positive Ames yet is still used in treatment today. Nitrates in food however may be reduced by bacterial action to nitrites which are known to generate carcinogens by reacting with amines and amides. Long toxicology and outcome studies are needed with such compounds to disprove a positive Ames test.

Fluctuation method

[sửa | sửa mã nguồn]
Fluctuation method: 96-well plate
Fluctuation method: 384-well plate

The Ames test was initially developed using agar plates (the plate incorporation technique), as described above. Since that time, an alternative to performing the Ames test has been developed, which is known as the "fluctuation method". This technique is the same in concept as the agar-based method, with bacteria being added to a reaction mixture with a small amount of histidine, which allows the bacteria to grow and mutate, returning to synthesize their own histidine. By including a pH indicator, the frequency of mutation is counted in microplates as the number of wells which have changed color (caused by a drop in pH due to metabolic processes of reproducing bacteria). As with the traditional Ames test, the sample is compared to the natural background rate of reverse mutation in order to establish the genotoxicity of a substance. The fluctuation method is performed entirely in liquid culture and is scored by counting the number of wells that turn yellow from purple in 96-well or 384-well microplates.

In the 96-well plate method the frequency of mutation is counted as the number of wells out of 96 which have changed color. The plates are incubated for up to five days, with mutated (yellow) colonies being counted each day and compared to the background rate of reverse mutation using established tables of significance to determine the significant differences between the background rate of mutation and that for the tested samples.

In the more scaled-down 384-well plate microfluctuation method the frequency of mutation is counted as the number of wells out of 48 which have changed color after 2 days of incubation. A test sample is assayed across 6 dose levels with concurrent zero-dose (background) and positive controls which all fit into one 384-well plate. The assay is performed in triplicates to provide statistical robustness. It uses the recommended OECD Guideline 471 tester strains (histidine auxotrophs and tryptophan auxotrophs).

The fluctuation method is comparable to the traditional pour plate method in terms of sensitivity and accuracy, however, it does have a number of advantages: it needs less test sample, it has a simple colorimetric endpoint, counting the number of positive wells out of possible 96 or 48 wells is much less time-consuming than counting individual colonies on an agar plate. Several commercial kits are available. Most kits have consumable components in a ready-to-use state, including lyophilized bacteria, and tests can be performed using multichannel pipettes. The fluctuation method also allows for testing higher volumes of aqueous samples (up to 75% v/v), increasing the sensitivity and extending its application to low-level environmental mutagens.[21]

References

[sửa | sửa mã nguồn]
  1. ^ Mortelmans K, Zeiger E (tháng 11 năm 2000). “The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay”. Mutation Research. 455 (1–2): 29–60. doi:10.1016/S0027-5107(00)00064-6. PMID 11113466.
  2. ^ Charnley G (2002). “Ames Test”. Encyclopedia of Public Health. eNotes.com. Bản gốc lưu trữ ngày 4 tháng 2 năm 2009. Truy cập ngày 2 tháng 5 năm 2014.
  3. ^ a b Ames BN, Durston WE, Yamasaki E, Lee FD (tháng 8 năm 1973). “Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (8): 2281–5. Bibcode:1973PNAS...70.2281A. doi:10.1073/pnas.70.8.2281. PMC 433718. PMID 4151811.
  4. ^ a b Ames BN, Gurney EG, Miller JA, Bartsch H (tháng 11 năm 1972). “Carcinogens as frameshift mutagens: metabolites and derivatives of 2-acetylaminofluorene and other aromatic amine carcinogens”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (11): 3128–32. Bibcode:1972PNAS...69.3128A. doi:10.1073/pnas.69.11.3128. PMC 389719. PMID 4564203.
  5. ^ a b Ames BN, Lee FD, Durston WE (tháng 3 năm 1973). “An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3): 782–6. Bibcode:1973PNAS...70..782A. doi:10.1073/pnas.70.3.782. PMC 433358. PMID 4577135.
  6. ^ a b McCann J, Spingarn NE, Kobori J, Ames BN (tháng 3 năm 1975). “Detection of carcinogens as mutagens: bacterial tester strains with R factor plasmids”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3): 979–83. Bibcode:1975PNAS...72..979M. doi:10.1073/pnas.72.3.979. PMC 432447. PMID 165497.
  7. ^ Hartwell L, Goldberg M, Hood L, Reynolds A, Silver L (2011). Genetics: from genes to genomes (ấn bản thứ 4). New York: McGraw-Hill. ISBN 978-0-07-352526-6. OCLC 317623365.
  8. ^ a b McCann J, Choi E, Yamasaki E, Ames BN (tháng 12 năm 1975). “Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12): 5135–9. Bibcode:1975PNAS...72.5135M. doi:10.1073/pnas.72.12.5135. PMC 388891. PMID 1061098.
  9. ^ Ames BN (tháng 5 năm 1979). “Identifying environmental chemicals causing mutations and cancer” (PDF). Science. 204 (4393): 587–93. Bibcode:1979Sci...204..587A. doi:10.1126/science.373122. JSTOR 1748159. PMID 373122.
  10. ^ Prival MJ, McCoy EC, Gutter B, Rosendranz HS (tháng 1 năm 1977). “Tris(2,3-dibromopropyl) phosphate: mutagenicity of a widely used flame retardant”. Science. 195 (4273): 76–8. Bibcode:1977Sci...195...76P. doi:10.1126/science.318761. PMID 318761.
  11. ^ Hayatsu, Hiroka (1991), Mutagens in Food: Detection and Prevention, CRC Press, tr. 286 pages, ISBN 978-0-8493-5877-7
  12. ^ Teasdale A (2011). Genotoxic Impurities: Strategies for Identification and Control. Wiley-Blackwell. ISBN 978-0-470-49919-1.
  13. ^ Tubiana M (tháng 9 năm 1992). “The carcinogenic effect of exposure to low doses of carcinogens”. British Journal of Industrial Medicine. 49 (9): 601–5. doi:10.1136/oem.49.9.601. PMC 1039303. PMID 1390264.
  14. ^ Jenkins GJ, Doak SH, Johnson GE, Quick E, Waters EM, Parry JM (tháng 11 năm 2005). “Do dose response thresholds exist for genotoxic alkylating agents?”. Mutagenesis. 20 (6): 389–98. doi:10.1093/mutage/gei054. PMID 16135536.
  15. ^ Forman D (tháng 8 năm 1991). “Ames, the Ames test, and the causes of cancer”. BMJ. 303 (6800): 428–9. doi:10.1136/bmj.303.6800.428. PMC 1670593. PMID 1912830.
  16. ^ Ames BN, Gold LS (tháng 10 năm 1990). “Chemical carcinogenesis: too many rodent carcinogens”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19): 7772–6. Bibcode:1990PNAS...87.7772A. doi:10.1073/pnas.87.19.7772. PMC 54830. PMID 2217209.
  17. ^ Twombly R (tháng 9 năm 2001). “Federal carcinogen report debuts new list of nominees”. Journal of the National Cancer Institute. 93 (18): 1372. doi:10.1093/jnci/93.18.1372. PMID 11562386.
  18. ^ Farmer PB, Walker JM (2006). The Molecular Basis of Cancer. Krieger Publishing Company. ISBN 978-0-7099-1044-2.
  19. ^ Hakura A, Suzuki S, Satoh T (tháng 1 năm 1999). “Advantage of the use of human liver S9 in the Ames test”. Mutation Research. 438 (1): 29–36. doi:10.1016/s1383-5718(98)00159-4. PMID 9858674.
  20. ^ Hakura A, Suzuki S, Satoh T (2004). “Improvement of the Ames test using human liver S9 preparation”. Trong Yan Z, Caldwell G (biên tập). Optimization in Drug Discovery: in vitro methods. Methods in Pharmacology and toxicology. Humana Press. ISBN 978-1-58829-332-9.
  21. ^ Bridges BA (tháng 11 năm 1980). “The fluctuation test”. Archives of Toxicology. 46 (1–2): 41–4. doi:10.1007/BF00361244. PMID 7235997. S2CID 23769437.

Further reading

[sửa | sửa mã nguồn]

Bản mẫu:Genotoxicity

Lấy từ “https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Thành_viên:Naazulene/Thử_nghiệm_Ames&oldid=71391718”